Халиуллина Алия Радиковна

МБОУ СОШ №98, г.Уфа, Республика Башкортостан

Научные руководители: Суханова Н.В., к.б.н., доцент каф. биоэкологии и биологического образования БГПУ им. М.Акмуллы,

Юсупова М.Н., учитель биологии МБОУ СОШ №98

ВЛИЯНИЕ ЗАСОЛЕНИЯ НА ПОЧВЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

Актуальность. Около 9·10⁸ га всех земель планеты имеют повышенное содержание солей, количество засоленных почв по разным причинам с каждым годом возрастает. Избыточное засоление негативно влияет на рост и развитие растений, почвенных микроорганизмов [1] [2] [3]. При этом небольшие концентрации солевого раствора могут стимулировать рост и развитие растения, улучшить их внешние показатели.

Цианобактерии являются космополитами и заселяют практически все наземные и водные биотопы, в том числе соленые водоемы, пустыни и городские почвы, характеризующиеся повышенным содержанием солей. Развитие микроорганизмов в урбаноземах происходит в специфических условиях, резко отличных от условий природных экосистем данного региона. Антропогенное воздействие на почву проявляется в неблагоприятных физических, химических и биологических процессах, приводящих к нарушению почвенного покрова, загрязнению, деградации [4].

При ослаблении развития высшей растительности под влиянием промышленного освоения территорий возрастает роль цианобактерий как составной части автотрофного блока экосистемы. Развиваясь на поверхности и в толще почвы, водоросли и цианобактерии оказывают влияние на её физико-химические свойства. Они синтезируют и выделяют в окружающую среду разнообразные вещества, улучшают водный режим и аэрацию почвы, препятствуют её эрозии [4]. По этому, изучение биологии и экологии отдельных видов почвенных микроорганизмов, в том числе и цианобактерий, является актуальной проблемой.

Целью настоящей работы являлось изучение влияния NaCl на морфологические показатели цианобактерии Nostocmuscorumи определение пределов устойчивости данного вида к засолению.

Для реализации поставленной цели выполнены следующие задачи: по литературным источникам изучены вопросы влияния засоления на растения и микроорганизмы, подготовлена накопительная культура цианобактерии Nostocmuscorum, изучена ее биология, подобрана методика проведения эксперимента (рассчитаны концентрации, а также количество и интервалы просмотров), изучено воздействие растворов соли NaCl различной концентрации на морфометрические показатели почвенной цианобактерии Nostocmuscorum, определены пределы ее устойчивости, изучено влияние растворов соли NaCl различной концентрации на спорообразование и цикл развития почвенной цианобактерии Nostocmuscorum.

Работа проведена на базе Научно-исследовательской лаборатории «Экология почвенных водорослей» им. Л.Хайбуллиной кафедры биоэкологии и биологического образования БГПУ им. М. Акмуллы.

Методика В качестве питательной среды для культивированияNostocmuscorum и получения накопительной культуры была использована среда Болда (3NNB). Штамм Nostocmuscorum был взят из коллекции наземных водорослей и цианобактерий БГПУ им. М.Акмуллы «BCAC» (Bashkortostan Collection of Algae and Cyanobacteria – Коллекция водорослей и цианобактерий Башкортостана), которая зарегистрирована в World Federation of Culture Collections (WFCC) (WDCM 1023)(http://www.wfcc.info/ccinfo/collection/by_id/1023) .

Далее были приготовлены методом разведения растворы соли NaCl в разных концентрациях: 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,56; 0,78; 0,39; 0,2 и 0,1 г/л дистиллированной воды. Затем были приготовлены концентрированные растворы солей для среды Болда.

Приготовленные растворы соли NaCl разливали по пробиркам в объеме 5 мл и добавляли по одной капле концентрированных растворов макроэлементов среды Болда (за исключением соли NaCl), для обеспечения цианобактерии элементами питания. В качестве контроля служила среда Болда в том же объеме. В пробирки с помощью микробиологической петли вносили небольшое количество культуры Nostocmuscorum. Вce paбoты пpoвoдили c coблюдeниeм пpaвил cтepильнocти. Пробирки закрывали ватно-марлевыми пробками, этикетировали и культивировали на люминостате при комнатной температуре.

При оседании культуры на дно пробирки ее периодически встряхивали. Первое снятие результатов эксперимента проводили чepeз 18 днeй co дня пocтaнoвки oпытa. Второе – через месяц со дня постановки опыта. В каждом испытуемом растворе соли NaCl и в контроле проводили измерение длины и ширины 100 клеток Nostocmuscorum. Кроме этого отмечали наличие в колонияхNostocmuscorum спорообразования, длины трихомов, состояние протопластов, окраску колоний, наличие колониальной слизи.

Измерения проводились с помощью микроскопа AxioImagerA2.

Экспериментальная часть. Через 18 дней и 30 дней после постановки опыта проводили описание морфологических признаков цианобактерии Nostocmuscorum, культивируемой в растворах NaCl разной концентрации.

В контроле при выращивании цианобактерии на питательной среде Болда колонии Nostocmuscorumимели насыщенный сине-зеленый цвет с серым оттенком. Большинство трихом были длинными (состояли более чем из 15 клеток). Трихомы лежали свободно, разнообразно изогнуто. Клетки перешнурованы, цилиндрической, бочковидной или сферической формы. Длина клеток варьировала от 2,25 до 5,72 мкм (в среднем 3,93 мкм). Ширина клеток составляла от 2,96 до 4,45 мкм (в среднем 3,55 мкм). Через месяц после посева культуры наблюдался процесс спорообразования , некоторые клетки трихом значительно увеличились в размерах, округлились, трихомы распадались на отдельные споры.

Колонии цианобактерииNostocmuscorum, культивируемые в солевом растворе концентрации 0,1 г/л имели цвет, варьирующий от темно до светло-зеленого с желтым оттенком. Большинство трихомов были длинными (состояли более чем из 15 клеток). Трихомы лежали свободно, разнообразно изогнуто, у отдельных трихомов хорошо заметны слизистые влагалища. Клетки перешнурованы бочковидной или сферической формы. Длина клеток варьировала от 2,23 до 6,11 мкм (в среднем 4,39 мкм). Ширина клеток составляла от 3,01 до 6,05 мкм (в среднем 4,25 мкм). Процесс спорообразования через месяц культивирования ярко выражен, цвет трихом стал значительно бледнее.

Цианобактерия Nostocmuscorum выращенная в солевом растворе концентрации 0,2 г/л имела колонии темно сине-зеленного цвета с серым оттенком, который через месяц изменился на светло зеленый с желтым оттенком. Большинство трихомов были длинными (состояли более чем из 15 клеток). Трихомы лежали свободно, разнообразно изогнуто. Клетки перешнурованы бочковидной или сферической формы. Длина клеток варьировала от 2,98 до 5,52 мкм (в среднем 4,27 мкм). Ширина клеток составляла от 2,88 до 4,71 мкм (в среднем 3,59 мкм). После месяца культивирования ностока в данном растворе, трихомы содержали большое количество гетероцист – бесцветных клеток участвующих в фиксации атмосферного азота, здесь также хорошо заметны влагалища, окружающие отдельные трихомы.

Цианобактерии Nostocmuscorum в солевом растворе концентрации 0,39 г/л имели колонии от желто-зеленого до серо-зеленого цвета со временем их окраска стала бледнее. Большинство трихомов были длинными (состояли более чем из 15 клеток). Трихомы лежали свободно, разнообразно изогнуто. Клетки перешнурованы бочковидной или сферической формы. Длина клеток варьировала от 2,58 до 5,87 мкм (в среднем 4,51 мкм). Ширина клеток составляла от 2,97 до 6,29 мкм (в среднем 4,62 мкм). На 18 день культивирования наблюдалось спорообразование. После месяца культивирования ностока в данном растворе, трихомы содержали большое количество гетероцист, здесь также хорошо заметны влагалища, окружающие отдельные трихомы, идет распад трихомов на споры.

Цианобактерии в солевом растворе концентрации 0,78 г/л имели бледно сине-зеленый цвет колоний с серым оттенком, со временем окраска изменилась на желто-зеленый цвет с серым оттенком. Большая часть трихомов плохо различима (безформенные). Трихомы лежали скученно, присутствовали как длинные, так и короткие трихомы. Клетки перешнурованы, в основном сферической формы, изредка угловатые. На 18 день культивирования наблюдалось спорообразование, а также лизис отдельных клеток и трихом в целом. Длина клеток варьировала от 2,7 до 6,25 мкм (в среднем 4,49 мкм). Ширина клеток составляла от 2,68 до 6,49 мкм (в среднем 4,68 мкм). Через месяц культивирования в колониях ностока встречаются отдельные гетероцисты.

Цианобактерии Nostocmuscorum в солевом растворе концентрации 1,56 г/л имели колонии от серо-зеленого до насыщено зеленого цвета с желтым оттенком. Трихомы в большей части короткие, сильно изогнутые, лежали свободно или скученно. Клетки перешнурованы, сферической формы либо угловатые. На 18 день культивирования наблюдалось спорообразование. Длина клеток варьировала от 3,37 до 6,87 мкм (в среднем 5,07 мкм). Ширина клеток составляла от 3,44 до 7,31 мкм (в среднем 5,12 мкм). Через месяц культивирования в колониях ностока встречалось большое количество пустых клеточных оболочек – мертвых клеток.

Цианобактерии Nostocmuscorumв солевом растворе концентрации 3,125 г/л имели колонии от темно-зеленого до серо-зеленого цвета, со временем цвет колоний стал бледным. Длина трихомов варьировала от коротких до длинных. Трихомы лежали скученно, разнообразно изогнуто. Клетки перешнурованы, бочковидной, сферической или угловатой формы. На 18 день культивирования наблюдалось спорообразование. Длина клеток варьировала от 3,33 до 6,96 мкм (в среднем 5,04 мкм). Ширина клеток составляла от 3,68 до 6,6 мкм (в среднем 4,87 мкм). В клетках ностока, культивируемого в данном растворе месяц, стали хорошо заметны крупные вакуоли, не характерные для клеток цианобактерий, кроме того в культуре присутствовало большое количество мертвых клеток.

Цианобактерии выращиваемые в солевом растворе концентрации 6,25 г/л имели колонии от темно сине-зеленного до серо-зеленого цвета. Большинство трихомов были длинными (состояли более чем из 15 клеток). Трихомы лежали свободно или скученно, разнообразно изогнуто. Клетки перешнурованы, бочковидной, сферической или угловатой формы. На 18 день культивирования наблюдалось спорообразование. Длина клеток варьировала от 3,55 до 7,11 мкм (в среднем 5,45 мкм). Ширина клеток составляла от 2,76 до 5,99 мкм (в среднем 4,86 мкм). Через 30 дней культивирования наблюдался лизис отдельных клеток и трихом в целом.

Колонии Nostocmuscorumв растворе NaCl концентрации 12,5 г/л имели серый цвет с зеленоватым оттенком до бесцветного. Только небольшое количество клеток имело сине-зеленую окраску. Большинство трихомов были бесформенными, лежали скученно, разнообразно изогнуто. Клетки перешнурованы, бочковидной, сферической или зачастую неправильной формы. Длина клеток варьировала от 2,74 до 5,8 мкм (в среднем 4,18 мкм). Ширина клеток составляла от 2,9 до 5,67 мкм (в среднем 4,25 мкм). Через месяц культивирования колонии состояли только из бесцветных мертвых трихом.

Колонии цианобактерииNostocmuscorumв растворе NaCl 25 г/л имели серый цвет, местами с зеленоватым и розовым оттенком. Только небольшое количество клеток имело сине-зеленую окраску. Большинство трихомов были бесформенными, лежали скучено. Клетки неправильной формы. Длина клеток варьировала от 2,51 до 6,26 мкм (в среднем 4,15 мкм). Ширина клеток составляла от 2,77 до 5,83 мкм (в среднем 4,64 мкм). 30-дневная культура ностока состояла из мертвых клеток.

Колонии Nostocmuscorum культивируемые в растворе NaClконцентрации 50 г/л имели серый цвет с сине-зеленым или фиолетовым оттенками, некоторые клетки имели зеленый цвет. Большинство трихомов были бесформенными, лежали скученно. Клетки в основном неправильной формы. Длина клеток варьировала от 2,87 до 6,58 мкм (в среднем 4,63 мкм). Ширина клеток составляла от 3,02 до 6,75 мкм (в среднем 4,82 мкм). Через 30 дней культивирования ностока в данном растворе все клетки были мертвыми.

Проанализировав данные эксперимента можно сказать, что даже малые концентрации раствора NaCl, приводят к изменению морфологических показателей цианобактерииNostocmuscorum - начиная с концентрации 0,1 г/л, изменяется цвет колоний, увеличивается размер клеток. Рассчитав ИТФ (индекс токсичности фактора) по отношению к размерным показателям клеток цианобактерии можно сказать, что повышение концентрации NaCl в растворе приводит к увеличению размеров клеток. ИТФ, согласно шкалы токсичности, относится к классу стимуляция и норма [5]. Статистическая обработка рeзультaтов с использованием критерия достоверности разницы по Стьюденту показала, что размеры клеток цианобактерии, культивируемой в растворах солей разной концентрации, достоверно отличаются от контроля при уровне доверительной вероятности р=0,95 и числе степеней свободы f =99.

Выводы. Анализ литературных источников по проблемам влияния засоления на растения и микроорганизмы и проведенный нами эксперимент показал, что избыточное содержание соли NaCl в среде оказывает существенное влияние на рост, развитие и морфологические признаки живых организмов. Цианобактерия Nostocmuscorum легко культивируется в лабораторных условиях, быстро растет и обладает довольно коротким циклом развития, позволяющим проследить морфологические изменения циаобактерии на разных стадиях развития в ходе эксперимента. Цианобактерия Nostocmuscorum является хорошим модельным организмом. Разработана методика проведения эксперимента по оценке влияния засоления на цианобактерии, подобраны концентрации соли, а также количество и интервалы просмотров. Для оценки морфологических изменений и жизнеспособности цианобактерий при воздействии растворов солей необходимо проводить как минимум 2 просмотра с интервалом не менее 2 недель и 1 месяца. Все концентрации раствора NaCl, начиная с 0,1 г/л, приводят к изменению морфологических показателей цианобактерииNostocmuscorum. Изменяется цвет колоний от темного сине-зеленого с серым оттенком до светло-зеленого с желтым оттенком и даже до бесцветного. Повышенное содержание NaClв среде приводит увеличению размера клеток. Установлены пределы устойчивости Nostocmuscorum, растворы соли  в концентрации 12,5-50 г/л  являются губительными для данной цианобактерии. Растворы соли NaCl в концентрации от 0,39 до 6,25 г/л уже на 18 день культивирования вызывали активное спорообразование у цианобактерии. В контроле образование спор наблюдалось через 30 дней после посева. При концентрациях соли от 0,20 до 0,78 г/л на 30 день культивирования у цианобактерии наблюдалось образование гетероцист. В клетках Nostocmuscorum, культивируемого в растворе соли 3,125 г/л в течение месяца появились крупные вакуоли, не характерные для клеток цианобактерий.

Список использованных источников

1. Гапочка Л.Д. Об адаптации водорослей. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1981. 80 с.

2. Фазлутдинова А.И. Эколого-флористическая характеристика почвенных диатомовых водорослей Южного Урала: Автореф. дисс... канд. биол. наук. Уфа. 999. 18 с.

3. Гайсина JI.A. Биология и экология Xanthonema exile (Klebs) Silva (Xanthophyceae, Chrysophyta): Автореф. дисс… к.б.н. Уфа, 2000. 17 с.

4. Гапочка Л.Д. Об адаптации водорослей. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1981. 80 с.

5. Кабиров Р.Р. Альготестирование и альгоиндикация (методические аспекты, практическое использование)/ Уфа: Башк. пед-т, 1995. 124 с.